dna的粗提取与鉴定中研磨液的作用「2022整理」

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dna的粗提取与鉴定中研磨液的作用

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dna粗提取研磨液的成分

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dna的粗提取与鉴定中研磨液的作用是什么

一 教学目的

1、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。

2、观察提取出来的DNA物质。

二 教学建议

在本实验的教学中，教师应注意以下几点。

1、实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。

3、获取较纯净的DNA的关键步骤。

(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。

(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。

(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。

三 参考资料

实验原理的补充介绍

1、DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

2、将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白*解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。

3、DNA的析出与获取 利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。

4、DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。

6、DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。

鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

二苯胺试剂的配制

B液： 乙醛的体积分数为0.2%的溶液。

配制： 将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。

DNA粗提取与鉴定的另一种方法

1、材料用具

新鲜菜花(或蒜黄、*)。

研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。

2、方法步骤

(1)DNA的粗提取

①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。

②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。

③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。

④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分后,再取上清液。

⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。

(2)DNA的鉴定

①配制二苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。

研磨液的配制方法

Tris：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。

NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)

EDTA：37.2 g(相对分子质量372.24)

SDS：20 g(相对分子质量288.3)

待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。

若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。

研磨液中几种药品的作用

SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。

EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。

物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。

Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基氨基甲烷)

1、配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。

2、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。

3、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。

dna提取中各种试剂的作用和原理

主要成分是：NaCl,Tris-HCl（PH=8），EDTA（PH=8），SDS。NaCl,Tris-HCl主要是调节溶液的PH,维持一定的离子浓度。EDTA主要是二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子和镁离子和EDTA结合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA；SDS主要是和蛋白质结合，使其变形沉淀，从而利于DNA的提取，减少和*带白质杂质！

DNA的粗提取与鉴定实验

DNA的粗提取与鉴定知识

1、DNA的粗提取与鉴定实验原理

(2)纯化原理：DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。

(3)鉴定DNA原理：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。

2、实验材料的选择及处理

(1)不选择猪血等哺乳动物的血液，因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。

(2)需要在鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠溶液，防止血液凝固。

(3)需除去鸡血中的血浆，因为血浆中无DNA。

特别提醒：不同生物的组织中DNA含量不同在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

3、生物实验过程

步骤：提取细胞核物质→溶解核内DNA→析出DNA粘稠物→滤取含DNA的粘稠物→DN A粘稠物的再溶解→过滤含有DNA的氯化钠溶液→提取含杂质较少的DNA→DNA的鉴定。

特别提醒：若以植物为实验材料，步骤上大致相同，在材料的处理上有几点不同：一是增加研磨步骤，目的是破坏细胞壁;二是加入洗涤剂，目的是溶解细胞膜及核膜;三是加食盐，可加速细胞膜及核膜的破裂。

4、DNA的粗提取与鉴定实验注意事项

(1)用冷酒精浓缩和沉淀DNA时所用的95%酒精，必须经过充分预冷后才能使用，冷酒精与含 DNA的氯化钠溶液体积比是2：1 。如果用冷酒精处理后，悬浮于溶液中的丝状物较少，可将混合液放于冰箱中再冷却几分钟，然后再用玻璃棒卷起丝状物。

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