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1、无论是不是哺乳动物,只要是真核生物,细胞膜的主要成分都是一样的,所以在鸡血里提跟在人身上提,结果是一样的;
2、作为研究材料,方便易得是一个重要的选择指标,在其他部分提取细胞膜和DNA都比较困难——比如肌肉、皮肤、脏器等,这些地方细胞都排列紧密,不容易分离出单个细胞体,更不容易提纯完整的细胞膜和DNA,只有血液中的血细胞之间不存在连接,单独游离在液体环境中,方便分离出单独的细胞;
3、人类等绝大部分哺乳动物的血细胞是没有细胞核的,也就没办法提取DNA,而鸡血细胞里是有细胞核的,可以用来提取DNA;
基因*具遗传魅力
在很多人的印象中,基因是谜一样的存在,因为它无法用肉眼察觉,而是存在于血液深层次下的神秘物质。但实际上,基因在人类文明进化的过程中仍有迹可循,就像儿子像父亲,女儿长得像母亲一样,这种带有血脉传承属性的成长轨迹正是基因的延续方式。基因也被称为DNA,也就是脱氧核糖核酸的缩写。在生物学的研究中发现,DNA是一种生物大分子,是由核苷酸重复排列组成的长链聚合物。就像是一颗枝繁叶茂的大树,DNA作为大树的主干为树叶输送源源不断的养分,而碳基和糖类集团借此互相交互形成枝繁叶茂的盛大场面
一 教学目的
1、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。
2、观察提取出来的DNA物质。
二 教学建议
在本实验的教学中,教师应注意以下几点。
1、实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。
3、获取较纯净的DNA的关键步骤。
(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。
(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。
(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。
三 参考资料
实验原理的补充介绍
1、DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。
2、将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白*解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。
3、DNA的析出与获取 利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。
4、DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。
6、DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是:DNA中呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。
鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
二苯胺试剂的配制
B液: 乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制: 将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA粗提取与鉴定的另一种方法
1、材料用具
新鲜菜花(或蒜黄、)。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。
2、方法步骤
(1)DNA的粗提取
①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定
①配制二苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。
研磨液的配制方法
Tris:10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。
l:8.76 g(相对分子质量58.44)
EDTA:37.2 g(相对分子质量372.24)
SDS:20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。
若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。
研磨液中几种药品的作用
SDS(基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。
EDTA(四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液:能很好地溶解DNA。
Tris/HCl:提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基)
1、配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的化乙锭(EB)溶液。
2、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。
3、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。
DNA提取主要是CTAB方法,其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有;硅质材料、阴离子交换树脂等。
提取DNA总的原则:
1、保证核酸一级结构的完整性;
2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的**溶剂和过高浓度的金属离子;
4、其他核酸分子,如RNA,也应尽量去除。
例如 : 用酶法提取
DNA提取分为三个基本步骤,每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
工具/原料: 研磨棒、研磨仪或者组织破碎仪 , 氯:异戊醇(24:1)或者蛋白酶 , RNA酶 , 酒精 , 冰箱
方法/步骤 :使用研磨仪、研磨棒或者使用超声破碎细胞的方法破碎细胞,加入去污剂,如sds等,除去膜脂。
去除细胞内的蛋白质,包括与DNA结合的组蛋白,通过加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯抽提等方法去除。
加入RNA酶去除RNA,如实验不严密,可省略此步。
沉淀DNA,需在冷乙醇或异丙醇中沉淀,放在冰箱-20℃沉淀30分钟以上,原理是DNA在醇中不可溶而黏在一起发生沉淀。
总结: DNA提取方法有下面⑦种
二。甲酰胺解聚法:破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
三。玻璃棒缠绕法:用盐酸胍裂解细胞,将裂解物铺于乙醇上,然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅,DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
四。异丙醇沉淀法:基本同1法,仅用二倍容积异丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态)
DNA提取的几种方法
(1)。浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些。
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用.15ML,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA。
(2)。阴离子去污剂法:
用SDS或二酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA 。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
(3)。苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持**状态 。
( 4)。水抽提法:
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