实验dna的粗提与鉴定,2023已更新|今日/热议

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实验dna的粗提与鉴定

一 教学目的

1、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。

2、观察提取出来的DNA物质。

二 教学建议

在本实验的教学中，教师应注意以下几点。

1、实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。

3、获取较纯净的DNA的关键步骤。

(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。

(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。

(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。

三 参考资料

实验原理的补充介绍

1、DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

2、将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白*解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。

3、DNA的析出与获取 利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。

4、DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。

6、DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是:DNA中呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。

鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

二苯胺试剂的配制

B液： 乙醛的体积分数为0.2%的溶液。

配制： 将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。

DNA粗提取与鉴定的另一种方法

1、材料用具

新鲜菜花(或蒜黄、)。

研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。

2、方法步骤

(1)DNA的粗提取

①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。

②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。

③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。

④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分后,再取上清液。

⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。

(2)DNA的鉴定

①配制二苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。

研磨液的配制方法

Tris：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。

l：8.76 g(相对分子质量58.44)

EDTA：37.2 g(相对分子质量372.24)

SDS：20 g(相对分子质量288.3)

待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。

若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。

研磨液中几种药品的作用

SDS(基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。

EDTA(四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。

物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。

Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基)

1、配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的化乙锭(EB)溶液。

2、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。

3、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。

dna的粗提取与鉴定知识点

DNA是生物的遗传物质，是生物的考点之一，需要学生去掌握，下面是我给大家带来的有关于高一生物的DNA的粗提取介绍，希望能够帮助到大家。

高一生物DNA的粗提取与鉴定知识点

该知识点主要包括DNA的方法、实验设计及操作提示等要点。

1、 提取DNA的方法：首先要掌握提取生物大分子的基本思路，其次是要掌握DNA提取与鉴定的具体方法。

当l溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低;当l溶液浓度**0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。

蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

在加热条件下，DNA遇二苯胺会生成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

2、 实验设计及操作提示：实验的步骤及注意事项是同学们要掌握的关键。

(1)制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因：制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡的红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上清液——血浆。

【DNA的粗提取与鉴定考点分析】

在平常测试中，该知识点多以选择题的形式出现。通常考查DNA的提取、鉴定方法及操作过程中的注意事项，出题形式灵活，难度不大。从近几年生物试题看，全国课标卷到目前还没有涉及到本专题的知识点;在单科生物卷中，涉及到了本部分知识，多以选择题形式出现，因此，记住相关基础知识是关键。

【DNA的粗提取与鉴定知识点误区】

提取、鉴定DNA的方法、不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料的原因、实验操作中两次使用蒸馏水的原因是本专题的易错问题，一定要把握住要点，记清细节知识(如知识点总结)，突破相关试题。

【典型例题】

某同学用洋葱进行DNA 粗提取和鉴定实验，操作错误的是( )

A。 加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨

B。 用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的 DNA

C。 加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌

D。 加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热

答案：A

解析：加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和，否则*产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作，A错误;利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开，起到纯化的作用，B正确;加入酒精溶液，静置溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，防止断裂，C正确;用二苯胺鉴定DNA需要水浴加热，D正确。

高一生物多聚酶链式反应扩增DN段知识点

该知识点包括PCR原理、PCR反应过程、实验操作及操作提示等几个要点知识。

1、 PCR原理：DNA热变性原理，即：

此外，DNA的合成方向也是必须掌握的知识要点。DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3、端，而磷酸基团的末端称为5、端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3、端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3、端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5、端向3、端延伸。

2、 PCR反应过程

(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：

(2)复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

(3)延伸：温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

3、 实验操作及操作提示：

【多聚酶链式反应扩增DN段考点分析】

在平常测试中，该知识点多以选择题或简答题的形式出现。通常考查DNA复制与PCR技术的区别、PCR反应过程等相关问题，出题形式图文兼有，灵活多样，但是难度不大。从近几年全国课标卷生物试题看， PCR技术没有在选修1的选做题中出现过，只是偶尔在选修3考查基因工程的选做题出现过个别填空，。因此，对于本部分知识记住关键的基础知识。2011年江苏生物卷33题中出现过该知识点，并且不都是简单的识记。

【多聚酶链式反应扩增DN段知识点误区】

不能准确把握PCR技术与DNA复制的区别是同学们易错的主因。

此外，对于PCR技术中的引物理解不到位也是失分的一个原因。可以从以下几方面 理解“引物”：①含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。②作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。③种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。④数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。⑤与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。

高一生物无土壤中分解尿素的的分离与计数知识点

该知识点包括研究思路(筛选菌株、统计菌落数目、设置对照)、实验设计及操作提示几个要点知识。

1、 尿素分解菌的分离与计数：

(1)土壤中的之所以能够分解尿素，是因为它们体内能合成酶。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。

(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

2、 实验设计：

土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→计数。

3、 操作提示：

(1)选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。

(2)选择培养基应用实例：

①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②培养基中加入高浓度的可得到金黄色葡萄球菌。

③培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

【土壤中分解尿素的的分离与计数考点分析】

本知识点主要考点集中在对尿素分解菌的鉴定方法上，其次是微生物计数的方法也是常见考点，但本部分多以选择题形式出现在考题中，以非选择的形式考查不常见。

【土壤中分解尿素的的分离与计数知识点误区】

1、显微镜直接计数法

①原理：利用特定计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。

③缺点：不能区分死菌与活菌。

2、间接计数法(活菌计数法)

②操作

a。设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

b。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

3、 分离分解尿素的的培养基应为选择培养基，培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成酶的微生物才能在上面生长。其配方如下：

KH2PO4　　　　　　 1.4g

Na2HPO4 2.1g

MgSO4·7H2O 0.2g

葡萄糖 10.0g

琼脂 15.0g

将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL。

【典型例题】可以鉴定出分解尿素的的方法是(　　)

答案：A

dna粗提取与鉴定实验过滤几次

1、实验中两次使用蒸馏水。

*二次是在析出含DNA的粘稠物后，目的是稀释L溶液，使DNA逐渐析出

2、加3次L，

*二次在DNA粘稠物在溶解时，家L是使DNA再溶解

*三次是在DNA的鉴定中，目的是溶解DNA

3、过滤3次

*二次在滤去含有DNA粘稠物只能够，滤液中含有仍然溶解在L中的细胞中的一些成分，如蛋白质等

*三次在过滤含DNA的2mol/L的L溶液时，过滤后的滤液中含有DNA

（三次过滤就行了，四次过滤是为了提取的更纯而已，要求不高时，可以省略）

鸡血dna粗提取过程

1、实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。

3、获取较纯净的DNA的关键步骤。

(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。

(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。

(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。

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